簡介
化學品引起的呼吸道過敏反應，不論是體內還是體外，目前尚缺少有效的評價方法。因此，新實驗方法的開發(fā)收到極大的關注，特別是考慮到REACH（《化學品注冊、評估、許可和限制》）新的法規(guī)規(guī)定。應注意的是，REACH指導方針明確指出，應盡量避免動物實驗，其中，化妝品材料應在2013年**禁止動物實驗。所以，建立體外模型顯得非常必須和十分的緊迫。
為了化學品呼吸道過敏反應的人肺體外模型的建立，我們開發(fā)一種三維共培養(yǎng)系統，模擬人肺肺泡區(qū)。該系統，采用氣液界面暴露技術，使體外培養(yǎng)的細胞在完全模擬人肺部環(huán)境下暴露于氣溶膠或顆粒物質。
方法
建立三種類型的共培養(yǎng)系統：
雙細胞共培養(yǎng)模型：
•人肺上皮細胞（ECs）：A549細胞
•人肺泡巨噬細胞（AMs）：U937細胞
三細胞共培養(yǎng)模型，類型1和類型2：
• ECs: A549 cells
• AMs: U937 cells, differentiated to AMs with PMA
• Human immature dendritic cells (DCs): DCs differentiated from human peripheral blood monocytes
ECs種在BD細胞培養(yǎng)插件上，培養(yǎng)7天。形成上皮細胞層后，AMs種在ECs層上。對于三細胞共培養(yǎng)類型1，DCs培養(yǎng)在細胞培養(yǎng)插件上（如圖1A）；對于三細胞共培養(yǎng)類型2，DC細胞種在上皮層內側（如圖1B）。
細胞培養(yǎng)的終點特征：
• EC層完整性：用Millicel-ERS (Millipore)測量跨上皮電阻（TEER）。
• EC層功能：表面活性蛋白(proSP-C)染色。
• Immature DCs: Staining of DC-marker CD1a and maturation markers CD83/CD86
使用體外
暴露染毒系統（如圖1C,D）的共培養(yǎng)模型對呼吸敏化劑和刺激物進行暴露染毒實驗。
結果
TEER測量：電阻值隨著時間增加。*高值出現在第7天（紅色箭頭），此時對插件進行處理（圖.2）。
圖 2: 每個值是3個腔室內測量的標準偏差平均值。
圖3：**細胞化學（A-C）和流式（D）的表面標記。A，B：ECs（A）和AMs（B）DAPI染色（藍色信號）和抗-proSP-C（紅色）。在ECs上檢測到ProSP-C，但是在AMs上檢測不到。C：DCs DAPI染色（藍色信號）和CD86（紅色）。大部分細胞CD86呈陰性（箭頭）。 D：DCs流式分析。
討論
以上是采用體外細胞暴露技術建立化學品呼吸道過敏反應的人肺體外模型。這種復雜三維細胞共培養(yǎng)體統的使用，我們能夠鑒定生物標記物的呼吸道過敏反應。由于體外暴露技術可以直接使用粉末狀顆粒物，不必要求必須具有水溶性特征，所以這一方法可擴展適用各種化學品。